PRUEBAS  BIOQUÍMICAS REALIZADAS

 A  ENTEROBACTERIAS

CATALASA

NITRITOS
CITOCROMO  OXIDASA PRUEBA AMINO-ACIDOS (CALDO DESCARBOXILASA DE MOELLER)
CITRATO ROJO DE METILO(RM)
(EOSINA-AZUL METILENO) EMB SIM (SULFURO-INDOL-MOTILIDAD)
HECKTOEN-ENTERICO (HE) SS (SALMONELLA SHIGELLA)
LIA ( LISINA-HIERRO) TSI (TRES AZUCARES-HIERRO)
MALONATO UREA
MAC CONKEY VOGES PROSKAUER (VP)
MOTILIDAD XLD ( XILOSA-LISINA-DESOXICOLATO)

 

(PRINCIPAL)              (ENTEROBACTERIAS)         (GLOSARIO)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

CATALASA

 

FUNDAMENTO La catalasa es una enzima que descompone el peroxido de Hidrogeno (H2O2) en agua y oxigeno. El peroxido de Hidrogeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo aerobio de los hidratos de carbono. Si se permite que se acumule resulta letal para la célula bacteriana.

La prueba de la catalasa se usa con mucha frecuencia para diferenciar miembros de la familia Micrococaceae de miembros de la familia Streptococcaceae.
 

 

MATERIALES Y

REACTIVOS

*Peroxido de Hidrogeno al 3% almacenado en frasco ámbar en frío.

*Cultivo de 18-24 horas del microorganismo a probar

 

PROCEDIMIENTO *Con un asa o palillo de madera, transferir parte del centro de una colonia  a la superficie de un portaobjetos

*Agregar 1 gota de Peroxido de Hidrógeno al 3% y observar la producción de burbujas

 

INTERPRETACION  la producción rápida y sostenida de burbujas o efervescencia constituye una reacción positiva.

 

NOTA los eritrocitos poseen cátalasa, por lo cual se debe evitar tomar colonias de agar sangre para evitar falsos positivos.

 

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ACTIVIDAD CITOCROMO-OXIDASA

 

FUNDAMENTO Los citocromos son Hemoproteinas que contienen hierro y actúan como el ultimo eslabón de la cadena respiratoria aerobia, transfiriendo electrones (Hidrogeno) al oxigeno, con formación de agua. El sistema citocromo se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos, de modo que la prueba de Oxidasa es importante para identificar aquellos organismos que carecen de esta enzima (anaerobios obligados). La prueba es muy útil para diferencia Enterobacterias (Todas Oxidasa negativas) de otras especies como Pseudomona  o Neisserias oxidasa positiva.

 

MATERIALES Y

REACTIVOS

Hay dos compuestos susceptibles a oxidarse por la acción de esta enzima, produciendo un color inicialmente rosado y luego azul oscuro a negro. Dichos compuestos son dimetil-fenil-diamina y tetrametil-parafenil-endiamina. Siendo el más utilizado el segundo, también se dispone en el mercado de tirillas de Oxidasa o el reactivo ya preparado.

 

INTERPRETACION Las colonias bacterianas con actividad de Citocromo-Oxidasa en segundos toman un color azul intenso en el sitio de la prueba. Para esta técnica no se debe utilizar asas de acero inoxidable, dado que los productos de Oxidación formados al esterilizarlas a la llama pueden producir reacciones falsas positivas. Por lo cual debemos utilizar palillos de madera.

 

 

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MAC CONKEY

 

FUNDAMENTO Agar selectivo y diferencial para el aislamiento de Enterobacterias. El medio contiene sales biliares y cristal violeta que son inhibidores de la microbiota Gram positiva. La lactosa junto al indicador Rojo neutro sirven para la comprobación de la degradación de dicho azúcar, dividiendo el grupo en 2: Bacterias fermentadoras y no fermentadoras de Lactosa.

 

TECNICA: Sembrar en el agar realizando siembra por agotamiento a partir del cultivo del microorganismo en estudio. Incubar 24 horas a 37º C.

 

INTERPRETACION Las colonias fermentadoras de lactosa dan un color rosado. Las colonias no fermentadoras de lactosa son incoloras, lo anterior por el comportamiento del indicador de pH.

 

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HECKTOEN-ENTERICO (HE)

FUNDAMENTO El agar HE es un medio de cultivo selectivo para la identificación de bacterias intestinales patógenas. La alta concentración de sales biliares inhibe el desarrollo de las bacterias Gram positivas. La Fucsina acida junto con el azul de Bromotimol reaccionan virando a amarillo al bajar le pH del medio por la acción de los ácidos producidos a partir de la fermentación de los 3 hidratos de carbono (Lactosa, Sacarosa, Salicina) que contiene el medio. La combinación de tiosulfato y una sal de hierro dan una coloración negra a las colonias H2S positivas.

 

TECNICA Inocular realizando siembra por agotamiento a partir del cultivo del microorganismo en estudio. Incubar a 37º C por 24 horas.

 

INTERPRETACION

Las bacterias fermentadoras rápidas de lactosa como Escherichiae coli forman colonias de color naranja brillante a rosa salmón.

  * Las colonias de Salmonella spp. Son de color azul verdoso con típicos centros negros por el gas H2S.

*Las colonias de Shigella spp. Son verde azulosas.

* Las cepas de Proteus spp son algo inhibidas, las colonias que se desarrollan son pequeñas y transparentes.

 

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XLD ( XILOSA-LISINA-DESOXICOLATO)

 

FUNDAMENTO La degradación a acido a partir de la Xilosa, lactosa y sacarosa producen un viraje a amarillo del indicador Rojo de fenol. El tiosulfato y sal de hierro revelan la formación de H2S por la precipitación del sulfuro de hierro negro en las colonias. Las bacterias que descarboxilan la lisina, producen cadaverina, se reconocen por la presencia de un color rojo-purpúreo debido al aumento de pH alrededor de las colonias. El efecto inhibidor es muy débil.

 

TECNICA Inocular realizando siembra por agotamiento a partir del cultivo del microorganismo en estudio, incubar a 37’ C por 24 horas.

 

INTERPRETACION

 Los microorganismos como E. coli, Klebsiella sp y Enterobacter so. Pueden utilizar más de un hidrato de carbono y formar colonias amarillas brillantes.

*La mayor parte de las especies de Salmonella y Arizona forman colonias Rojas, la mayoria con centro negro debido a la producción de H2S.

 *Los géneros Shigella, Providencia y algunas cepas de Proteus no utilizan ningún hidrato de carbono y forman colonias translucidas.

  *Las colonias que solo fermentan la Xilosa presentaran un color Naranja.

 

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SS (SALMONELLA SHIGELLA)

 

FUNDAMENTO El agar SS es un medio altamente selectivo que inhibe el desarrollo de la mayoria de coniformes y permite el desarrollo de las especies de Salmonella y Shigella. La alta concentración de sales biliares y citrato se sodio inhibe a todas la  bacterias Gram positivas y a algunas Gram negativas. La Lactosa es el único hidrato de carbono y el Rojo neutro detecta la producción de acido. El tiosulfato de sodio es una fuente se azufre y las bacterias que producen H2S se detectan por la presencia de un precipitado negro por el citrato ferrico.

 

TECNICA Inocular realizando siembra por agotamiento a partir del cultivo del microorganismo en estudio, incubar a 37’ C por 24 horas.

 

INTERPRETACION las cepas de Shigella y la mayoria de Salmonella presentan colonias incoloras. Colonias trasparentes con centro negro: Proteus y algunas Salmonellas. Las bacterias fermentadoras de Lactosa presentan colonias rojas a rosadas.

 

(REGRESAR)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

EMB

(EOSINA-AZUL METILENO)

 

FUNDAMENTO  Es una agar selectivo para el aislamiento de Enterobacterias patógenas. Los colorantes de anilina (Eosina y azul de metileno) inhiben las bacterias Gram positivas y las Gram negativas exigentes nutricionalmente. También se combinan precipitándose a pH acido actuando como indicadores de producción de ácidos de los carbohidratos presentes en el medio (Lactosa y Sacarosa)

 

TECNICA

Inocular realizando siembra por agotamiento a partir del cultivo del microorganismo en estudio, incubar a 37’ C por 24 horas.

 

INTERPRETACION Las colonias fermentadoras son de color rosado. Escherichiae coli fermenta los azucares y forma colonias verdes con brillo metálico. Las colonias no fermentadoras son incoloras,

 

(REGRESAR)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

CITRATO

 

FUNDAMENTO

El citrato de sodio es una sal del acido cítrico, un compuesto orgánico simple que constituye uno de los metabolitos del ciclo de los ácidos tricarboxilicos. Generalmente los microorganismos que emplean el citrato como única fuente de carbono, utilizan sales de amonio como única fuente de nitrógeno. El metabolismo del citrato realizado, por algunas bacterias se realiza por el ciclo de krebs y requiere el desdoblamiento del citrato por la enzima citritasa (citrato-oxalacetato-liasa o citrato desmolasa) en presencia de  magnesio o manganeso y de transportadores como citrato permeasas. 

La citritasa actúa sobre el citrato produciendo acido oxalacetico y acetato; productos que son convertidos enzimaticamente a piruvato y dióxido de carbono. Durante esta reacción el medio comienza a alcalinizarse por el CO2 que se genera, el cual se combina con el agua y el sodio para formar Carbonato un producto alcalino, este carbonato da la alcalinidad que produce el cambio de color del indicador de pH del medio de verde a azul Prusia oscuro (indicador: azul de bromotimol, amarillo a pH< de 6.0 y azul a pH > de 7.6). El medio incluye citrato como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno.

 

TECNICA Inocular el tubo con agar citrato de Simmons realizando siembra por estría tomando una colonia del microorganismo en estudio. Incubar a 37 grados C por 24 horas.

 

INTERPRETACION El desarrollo de un color azul intenso  en 24-48 horas indica una prueba positiva y revela que el microorganismo en estudio ha sido capaz de utilizar el citrato en el medio con la formación de productos alcalinos. La prueba también es positiva en ausencia de color azul si existe crecimiento del microorganismo a lo largo de la estría de inoculación.

 

(REGRESAR)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

TSI

( TRES AZUCARES-HIERRO)

 

FUNDAMENTO

Es una prueba usada para la fermentación de la glucosa, lactosa y sacarosa y la producción de H2S por parte de la bacteria sumándole producción de gas. El cambio de color rojo-anaranjado (color inicial del medio) a amarillo indica fermentación. Si se fermenta únicamente la glucosa el cambio de color del medio ocurre solamente en el fondo debido a que se encuentra 10 veces menos concentrada que la sacarosa y la lactosa, además los radicales libres no son suficientes para hacer virar el medio.

 Si se fermentan los 3 azucares hay cambio de color tanto en la superficie como en el fondo. La presencia de burbujas que rompen el medio  y a veces tienden a expulsarlo indica presencia de gas como producto final de la fermentación.

 La producción de H2S se manifiesta por la aparición de un precipitado color negro debido a la reducción de la sal de hierro presente en el medio.

 

TECNICA Inocular el medio realizando siembra mixta del microorganismo en estudio, incubar a 37 grados C por 24 horas.

 

INTERPRETACION

 

A: Reacción acida. Color amarillo             A/A: Fermentación 3 azucares

K: Reacción alcalina. Color roja naranja   K/A:  Fermentación de la glucosa

Burbujas: Producción de gas                   K/K: No hay fermentación de los 3

Precipitado negro: Formación H2S

 

 

(REGRESAR)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

LIA

 ( LISINA-HIERRO)

 

FUNDAMENTO

Es un medio que sirve para demostrar la producción de dos enzimas: la lisina descarboxilasa y la lisina desaminasa, además la presencia de sales de hierro sirve para detectar la producción de H2S por algunos microorganismos.

 La descarboxilacion de la lisina ocurre en ambiente anaeróbico o sea en el fondo del tubo y se pone de manifiesto por la alcalinización del medio produciendo un viraje del indicador púrpura de bromocresol. La presencia de glucosa en los componentes del LIA determina primero una reacción de fermentación, produciendo acidificación  y cambio de color del medio a amarillo y el pH favorable para la reacción de descarboxilacion que ocurre después, volviendo a su color violeta original la parte del fondo del tubo.

 La desaminacion de la lisina que se puede producir por los géneros Proteus  y Providencia tiene lugar en la parte superior del tubo produciendo acido a cetocarbonico que al combinarse con la sal de hierro y en presencia de oxigeno forma un color violeta rojizo. La producción de H2S se evidencia por la presencia de un precipitado negro por utilización de las sales de hierro.

 

TECNICA

Inocular realizando siembra mixta con doble picadura a partir de una colonia del cultivo del microorganismo en estudio e incubar 24 horas a 37 grados C

 

INTERPRETACION

A: Reacción acida. Color amarillo    

K: Reacción alcalina. Color violeta  

R: Reacción alcalina: color rojo

 K/K: Descarboxilacion lisina

K/A: Fermentación glucosa.  Descarboxilacion lisina

R/A: Desaminacion lisina. Fermentación glucosa

 

(REGRESAR)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

SIM

 ( SULFURO-INDOL-MOTILIDAD)

 

FUNDAMENTO

El indol, es uno de los productos de la degradación metabólicas del amino acido triptofano. Las bacterias que producen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con producción de Indol, acido piruvico y amoniaco. La prueba del indo esta basada en la formación de un complejo rojo cuando el Indol reacciona con el grupo aldehído  p-dimetilaminobenzaldehido. Este es el principio activo del reactivo de Kovacs.

MEDIO DE CULTIVO: agar SIM o caldo triptofano

 

TECNICA Inocular  al medio realizando siembra por picadura hasta la mitad del medio a partir del cultivo del microorganismo en estudio. Incubar 24 horas a 37 grados C. al finalizar este periodo añadir 5 gotas del reactivo de Kovacs por la pared del tubo.

 

INTERPRETACION El desarrollo de un color rojo-fucsia  en la interfase del reactivo y de los medio segundos después añadir el reactivo de Kovacs indica la presencia de indol y por lo tanto una prueba positiva.

 

 

(REGRESAR)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

MOTILIDAD

 

FUNDAMENTO Me permite determinar la capacidad de movimiento por parte de un microorganismo.

 

TECNICA Siembra en picadura con el microorganismo a estudiar, incubar 24 horas a 37 grados C

 

INTERPRETACION Formación de nata la parte superior de medio indica viabilidad del microorganismo, desarrollo de turbidez hacia los lados de la estría de inoculación indica motilidad positiva.

 

(REGRESAR)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ROJO DE METILO

 (RM)

 

FUNDAMENTO

Determinar la capacidad de un microorganismo para producir  y mantener estables los productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa y vencer la capacidad amortiguadora del sistema. La prueba Rojo de metilo es cuantitativa para la producción de acido y requiere que los microorganismos produzcan ácidos fuertes a partir de la glucosa, de forma que el medio del pH descienda a menos de 4.4. Esta distinción puede hacerse a través del indicador Rojo de metilo que presenta color amarillo por encima de un pH de 5.1 y solo presenta color rojo cuando el pH desciende a 4.4.

 

REVELADOR Rojo de metilo

 

TECNICA  Inocular en el caldo RMVP con una colonia del cultivo del microorganismo en estudio. Incubar 24-48 horas a 37º C. finalizado este periodo adicionar 5 gotas del revelador Rojo de metilo.

 

INTERPRETACION El desarrollo de un color rojo estable en la superficie del medio indica que la producción de acido es suficiente como para bajar el pH a 4.4 y es una prueba positiva. Cuando ocurre la formación de un color amarillo la prueba es negativa.

 

(REGRESAR)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

VOGES PROSKAUER

(VP)

 

FUNDAMENTO Determinar la capacidad de algunas bacterias para generar un producto final neutro (acetoina y 2,3 Butanodiol) a partir de la fermentación d ela glucosa. Los productos neutros formados en la presencia  de oxigeno atmosférico, alcalisis (Hidróxido de Potasio al 40%) y peptonas, se oxidan en diacetilo, reactante para el color producido en la reacción. El Alfa naftol actúa como catalizador para revelar un complejo color rojo.

 

REVELADOR

Solución A: Alfa naftol al 5% en etanol absoluto

Solución B: Hidróxido de Potasio al 40% en agua  destilada.

 

TECNICA Inocular en RMVP con una colonia del cultivo del microorganismo en estudio. Incubar a 37º C por 24 horas. Al finalizar este periodo adicionar 6 gotas (0.6ml) de la solución A y 2 gotas (0.2ml) de la solución B. dejar en reposo durante 10-15 minutos.

 

INTERPRETACION Una prueba positiva esta indicada por el desarrollo  de un color rojo a los 15 minutos de añadido los reactivos reveladores por la presencia de acetoina. Una prueba negativa da un color cobrizo.

 

(REGRESAR)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

MALONATO

 

FUNDAMENTO El malonato de sodio, es una sal orgánica que es utilizada por las bacterias como única fuente de carbono con formaron de productos alcalinos que  se evidencia por un viraje de verde a azul del indicador del medio, azul de Bromotimol. Si un microorganismo es capaz de utilizar el malonato de sodio como única fuente de carbono, al mismo tiempo que utilizar el sulfato de amonio como fuente de nitrógeno, se produce un aumento de la alcalinidad  que se debe a la formación de Hidróxido de sodio (NaOH).

 

TECNICA inocular 1-2 asadas del microorganismo en el Caldo Malonato, incubar a 37º C por 24 horas.

 

INTERPRETACION El cambio de color de verde a azul indica una prueba positiva.

 

(REGRESAR)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

UREA

 

FUNDAMENTO Los microorganismos que poseen la enzima Ureasa tienen la capacidad de hidrolizar la urea  contenida en el medio con producción de amoniaco, para esta prueba se utiliza el caldo urea de stuart o agar urea de christensen. El caldo sturat esta estabilizado con sales de fosfato a un pH de 6.8. el microorganismo en estudio debe producir cantidades relativamente grandes a fin de superar el sistema estabilizador del medio y elevar el pH del medio los suficiente como para virar el indicador (por encima de 8.0)

 

TECNICA inoculación en caldo, incubar a 37º C por 24 horas.

 

INTERPRETACION Un cambio de color Rojo fucsia indica que la urea fue hidrolizada por la ureasa del microorganismo. Ausencia de cambio de color indica reacciona negativa

 

(REGRESAR)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

PRUEBA AMINO-ACIDOS (CALDO DESCARBOXILASA DE MOELLER)

 

FUNDAMENTO

El caldo descarboxilasa de Moeller es el medio base mas comúnmente utilizado para determinar la capacidad de descarboxilacion de amino-ácidos por las Enterobacterias.

 El amino-acido por ensayar se añade al medio base antes de inocular el microorganismo en estudio. Se debe emplear paralelamente un control que consiste en un tubo con medio base sin el amino-acido. Ambos se incuban anoxigénicamente adicionando una capa de aceite mineral estéril.

 Durante las etapas iniciales de incubación ambos tubos se vuelven amarillos debido a la fermentación de la pequeña cantidad de glucosa del medio (pH 5.6). Si el amino-acido es descarboxilado se forman aminas alcalinas y el medio retorna a su color púrpura inicial. Los amino-ácido Lisina, Arginina y Ornitina son 3 amino-ácidos ensayados y producen las siguientes aminas específicas.

Lisina                                  Cadaverina (Descarboxilasa)

 Ornitina                               Putrescina (Descarboxilasa)

 Arginina                               Citrulina ( Dihidrolasa)

 

TECNICA Inocular con material de una colonia del cultivo del microorganismo en estudio, dos tubos de caldo de Moeller, uno con el amino-acido y otro sin este (control). Cubrir ambos tubos con una capa de aceite mineral estéril. Incubar a 37º C por 24 horas.

 

INTERPRETACION El desarrollo de un color amarillo en el tubo control indica que el microorganismo es viable y que el pH del medio ha disminuido lo suficiente para activar las enzimas  descarboxilasas. El retorno al color púrpura o violeta del tubo que contiene el amino-acido indica una reacción positiva debido a la liberación de aminas por descarboxilacion.

 

arginina  (+)                                  ornitina (+)                            lisina (+)

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NITRITOS

 

FUNDAMENTO Determinar la capacidad de un microorganismo de reducir los Nitratos o gas Nitrógeno libre. La reducción de Nitrato (NO3) a Nitrito (NO2) y a Nitrógeno gaseoso (N2) se produce en condiciones de anaerobiosis, en las cuales el microorganismo produce su oxigeno del Nitrato. El oxigeno actúa como un aceptor de Hidrógeno; es decir el protón y el aceptor final de protones. La mayoría de las bacterias aerobias son anaerobias facultativas y solo pueden reducir los Nitratos en ausencia de oxigeno.

 

REVELADOR:

La presencia de Nitritos se detecta en el medio, añadiendo el reactivo de Griess- llovays, con al formación de un colorante Rojo de Diazonio.

 

PROCEDIMIENTO Inocular el medio de Nitrato con una parte de la colonia del cultivo Axenico del microorganismo en estudio. Incubar 24 horas a 37º C. después de este tiempo añadir 5 gotas del reactivo de Griess-llovays.

 

INTERPRETACION El desarrollo de un color rojo después de añadir el reactivo, indica la presencia de Nitritos y representa una prueba positiva. La ausencia del color tras el agregado del reactivo puede indicar que los nitritos no han sido reducidos (Una verdadera prueba negativa), o que han sido reducidos a productos distintos de los nitritos, como Amoniaco, Nitrógeno molecular u Oxido  Nitroso e Hidroxilamina. Por lo tanto es necesario añadir una pequeña cantidad de polvo de zinc a todas las reacciones negativas. Los iones de Zinc reducen los nitratos a Nitritos y el desarrollo de un color Rojo tras agregar polvo de zinc indica la presencia de nitratos residuales y confirma la reacción negativa verdadera. Si no hay cambio de color tras agregar el polvo de zinc indica que los nitratos fueron reducidos a otros compuestos como amoniaco, Nitrógeno molecular, Oxido Nitroso e Hidroxilamina.

 

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